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                科研

                首頁 - 全部文章 - 科研 - 基于納米孔MinIon測序儀的白血病快速檢測方法,相較二代測序優勢明顯

                基于納米孔MinIon測序儀的白血病快速檢測方法,相較二代測序優勢明顯

                在本周召開的美國血液學學會年會(ASH)上,來自俄亥俄州立大學的研究人員報告了一種基于納米孔測序的急性髓細胞性白血?。ˋML)快速檢測方法,可在幾個小時內檢測分析AML患者血液樣本中可用于臨床和可預測的生物標志物。同時,研究團隊還介紹了相關的驗證研究結果,比較了該方法與短讀長測序在檢測AML相關變異方面的能力。

                據悉,該檢測方法由俄亥俄州立大學的Esko Kautto和James Blachly領導的研究團隊開發,是基于Oxford Nanopore Technologies公司的MinIon測序儀進行設計,旨在對AML患者的血液DNA進行快速分析,使檢測到的基因組變異可用于指導治療或告知預后。研究人員認為,雖然該檢測方法仍需在更大的隊列中進行進一步的驗證和評估,然后才能在臨床中使用,但在不久的將來,該檢測仍可能成為當前金標準方法的一種更快、更具成本效益的替代方法。

                圖:MinIon測序儀,來源:Oxford Nanopore Technologies官網

                AML快速納米孔測序檢測方法的開發

                白血病是一類造血干細胞惡性克隆性疾病。AML占急性白血病的60%以上,多數病例病情急重、預后兇險,5年生存率僅為24%。AML通常具有侵襲性,因此患者在確診的后必須迅速接受治療。隨著二代測序技術(NGS)的推廣,新型靶向藥物在AML治療中不斷涌現,部分藥物已被批準用于攜帶某些基因突變的患者。

                靶向治療需要靶向診斷。目前,基于NGS的檢測方法耗時較長。主要學術癌癥中心的NGS方法可能需要一周以上的時間,而且無法進行檢測的腫瘤科可能需要轉診患者。延誤治療或不恰當的治療都可能對AML等侵襲性疾病患者造成嚴重影響。如果能成功開發出一種適用于臨床的快速檢測方法,將對AML的分子診斷起到重要作用。同時,該方法還可用于AML臨床試驗篩選,作為伴隨診斷指導特定藥物的治療,也可用于監測微小殘留病灶,以評估AML患者是否可以停用某種藥物或進行其它治療。

                為達到這一目的,Kautto研究團隊決定基于納米孔測序開發一種快速檢測方法。該方法依賴于擴增子文庫和一個計算框架,可在測序儀產生數據后立即開始分析。在幾個小時內,研究人員就可以得到大量測序數據的分析結果,以及在患者樣本中檢測到的任何突變的分析報告。

                納米孔測序比傳統NGS更快,并且在儀器成本方面更便宜,但納米孔測序具有更高的原始read錯誤率。據Kautto估計,納米孔測序的原始錯誤率約為10%,對于低頻突變檢測來說,這一錯誤率就比較高了?!拔覀兓舜罅繒r間分析錯誤,并優化策略以減少錯誤的出現,我們認為這是該研究中最大的挑戰之一?!?/p>

                為解決這一難題,研究團隊建立了質量分數的臨界值,以過濾掉質量較低的測序數據,從而降低錯誤率。Kautto 表示:“這確實是可行的,因為將來自儀器的原始信號轉換為核苷酸序列的算法可衡量其檢出堿基的可信度。我們可以發現質量較低的reads,并將其排除在分析之外?!?/p>

                新檢測方法的性能驗證

                為驗證新檢測方法的性能,研究團隊在72個野生型和突變樣本中比較了納米孔測序方法和短讀長測序(Illumina的MiSeq測序儀)、毛細管電泳檢測AML相關基因突變的能力,涉及8個基因:DNMT3A、FLT3、IDH1、DH2、JAK2、NPM1、NRAS、KRAS,并討論分析了不同方法在三種類型變異中的檢測性能,包括JAK2熱點突變、NPM1移碼插入和FLT3內部串聯重復。

                結果顯示,在檢測JAK2熱點突變方面,納米孔測序和MiSeq在8個突變體樣本中表現出較高的相關性,等位基因分數的范圍很廣,在4%~94%之間。同時,研究人員還評估了納米孔測序檢測NPM1移碼插入的能力。這種移碼插入在30%的患者中發生突變,并且與AML復發風險增加有關。Kautto認為:“盡管納米孔測序在indels缺失檢測中有很高的錯誤率,但NPM1移碼插入是序列末端獨特核苷酸插入,突變特征非常明顯。我們可以在背景噪聲中將其識別出來,并且它實際上不會隨機出現在我們的數據中。雖然在這種情況下檢測到的等位基因變異比例低于預期,但這可以通過線性模型進行捕捉調整?!?/p>

                FLT3內串聯重復突變可導致AML患者的預后較差,目前已有多種靶向藥物靶向這類突變。該突變可導致外顯子13到15的多個部分重復,是一種很長的插入突變,很難用傳統的NGS來檢測。因此,FLT3內串聯重復突變檢測的金標準是毛細管電泳法。

                研究團隊利用48份樣本比較了不同方法的檢測性能,其中24份為毛細管電泳檢測陽性。結果顯示,納米孔測序檢測到所有24例陽性樣本,傳統NGS只檢測到其中的6例陽性樣本。研究人員認為,納米孔測序檢測到的等位基因比率與毛細管電泳相似,兩者都確定了幾乎相同長度的內部串聯重復突變。更重要的是,納米孔測序可在4~6小時內獲得檢測結果,傳統NGS檢測可能需要幾天時間。

                此外,這種基于納米孔測序的檢測方法也具有成本優勢。在這項研究中,Kautto的研究團隊使用MinIon flow cells,為樣本添加條形碼,可以一次收集和分析多個樣本。據研究人員估計,利用FLongle flow cells進行分析,每個樣本的成本將低于250美元。Kautto表示:“最理想的情況是使用一些較小的芯片以降低成本,還可以為患者樣本進行單獨檢測。在臨床檢測環境中使用小型芯片將更安全,可避免樣本污染?!?/p>

                未來,該研究團隊計劃與其他大學合作,使用更多樣本來驗證這項檢測方法。同時,他們還將改進計算步驟和文庫制備,優化每個目標的覆蓋率,完善其他基因分析,包括TP53等基因,并最終通過CLIA或CAP驗證。

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                本文由 SEQ.CN 作者:陳初夏 發表,轉載請注明來源!

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