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                科研

                首頁 - 全部文章 - 科研 - 基于單個胞外囊泡EVs的高通量液體活檢技術,助力疾病診斷與動態檢測

                基于單個胞外囊泡EVs的高通量液體活檢技術,助力疾病診斷與動態檢測

                研究背景

                細胞外囊泡(EVs)是一般小于1000nm,由被脂質雙分子層分隔的細胞中自然釋放出來的顆粒。EVs包括核內體來源的外泌體(30-150nm)和質膜來源的微泡。EVs包含蛋白質、DNA、mRNA和非編碼RNA(如miRNAs和lncRNA)。最新研究結果表明,EVs與腫瘤的起始、發展和轉移高度相關,使其成為潛在的癌癥檢測生物標志物。例如,癌細胞釋放的外泌體PD-L1可以通過遠程阻斷CD8+ T細胞上的PD-1來促進腫瘤進展。因此,在免疫治療期間監測外泌體PD-L1的表達水平是至關重要的。

                作為一種液體活檢方法,EVs具有多種優勢,如生物液的豐富性及保護蛋白質和核酸不被其脂質雙層膜降解等。然而,由于過小的體積(50-1000nm),其內蛋白質和核酸的量化十分具有挑戰性。

                近日,來自上海復旦大學附屬中山醫院的研究團隊開發的高通量納米生物芯片集成系統液體活檢系統(High-throughput Nano-bio Chip Integrated System for Liquid Biopsy,HNCIB)。該技術是首個能夠從EVs表面和腔內同時檢測和分析多種生物標志物的技術,有望成為同時檢測疾病特異性EVs表面蛋白和內部分子的新平臺,提供更全面的EVs表型和疾病狀態信息,提高疾病診斷、治療動態監測及預后的敏感性、特異性和準確性。

                文章發表在Science advances

                研究內容與結果

                1.HNCIB系統單EV分析的原理驗證

                電子顯微鏡圖像和動態光散射(DLS)粒度分析證實了目前分離得到的EVs主要是外泌體。???隨后,研究人員采用HNCIB系統對分離的EVs進行分析,TIRFM(全內反射熒光顯微鏡)圖像顯示了單個EV的數量富集,說明HNCIB系統對EVs具有較高的捕獲效率。接著利用HNCIB系統,在從人血漿中分離的EVs上檢測到CD9和CD63這兩種經典的EV標記,而ALB和APOB這兩種非EV標記物中的熒光信號極低。這些結果證實了HBNIC系統成功且高效地捕獲了EVs,以及在單EV水平上的高分辨率成像能力。

                圖1. HNCIB系統設計。來源:Science advances

                2.驗證HNCIB系統在EVs中的特異性、敏感性和蛋白定位檢測

                為了驗證HNCIB系統能夠特異、敏感地檢測EVs上的特異性蛋白表達,團隊進行了多個對照實驗:

                CD63和PD-L1抗體染色的EVs均顯示高強度的熒光信號(信號強度分別是EV同型對照的9倍和7倍),說明HNCIB系統可以特異性檢測EVs上的CD63和PD-L1蛋白。

                非EV標志物ALB和APOB抗體染色的EVs信號相對較低,而CD9或CD63抗體染色的EVs顯示高熒光信號(至少是ALB或APOB染色EV的10倍)。對CD63-GFP(綠色熒光蛋白)表達的EVs信號進行一系列稀釋,評估HNCIB系統的敏感性。即使稀釋倍數為1:1000時,也能檢測到信號,說明HNCIB系統具有較高的靈敏度,能夠檢測CD63-GFP表達的EVs的變化。

                圖2. PD-L1蛋白在EVs上表達的驗證。來源:Science advances

                研究人員進一步利用HNCIB系統證實了CD63和PD-L1在部分EV粒子上共存,并利用Sobel邊緣檢測算法計算出表達這兩種蛋白的EV亞群在整個EVs群體中的比例。

                圖3. CD63和PD-L1膜蛋白的雙免疫熒光染色。來源:Science advances

                3.同時檢測體外EVs上PD-L1 mRNA和蛋白的表達

                為了驗證該技術在體外檢測EVs上PD-L1 mRNA和蛋白表達的變化,研究人員在A549細胞中過表達PD-L1,并利用HNCIB系統分析從過表達的細胞中分離得到的EVs中的PD-L1 mRNA和蛋白。結果表明,PD-L1-A549細胞EVs中PD-L1 mRNA和蛋白的表達明顯高于載體-A549細胞。這與RT-qPCR和Western blotting分析結果一致,證實了HBNIC系統能夠同時檢測腔內RNA和表面膜蛋白。

                圖4. 體外EV mRNA和蛋白表達測定。來源:Science advances

                4.臨床應用

                接著,研究人員招募了34名LUAD(肺腺癌)患者和35名健康捐贈者,并使用HNCIB系統對肺癌患者血漿中的EVs進行檢測。既往研究表明,外泌體中miR-21可作為于肺癌檢測的miRNA生物標志物,研究發現,與既往研究結果一致,LUAD患者EVs的PD-L1 mRNA及蛋白表達水平均明顯高于健康供體EVsPD-L1 mRNA及蛋白表達水平。

                值得注意的是,雖然健康供體組和LUAD患者組的三個標志物均有統計學差異,但PD-L1蛋白在兩組間的分離較PD-L1 mRNA和miR-21的差異更為明顯。對于相同的疾病,不同的生物標志物的特異性是不同的,單一的生物標志物可能并不總是足以進行正確的診斷及預后。同時檢測多個生物標志物,將大大提高診斷及預后的準確性。

                圖5. 測定從人血漿中分離的EVs的miRNA、mRNA和蛋白表達。來源:Science advances

                小結

                該研究開發的HNCIB系統使用高通量納米生物芯片進行高效、定向EVs捕獲,并使用全內反射熒光顯微鏡(TIRFM)進行快速、高分辨率檢測。其開發的深度算法可以實現自動化分析,獲得關于mRNA/miRNA和膜蛋白分布的半定量到定量信息,以及多種蛋白的分配和比例信息。

                該技術允許快速的單EV分析(總分析時間約為6小時),并且只需要非常小的樣本量即可(約90μl血漿)。據悉,該技術是首個能夠從EVs表面和腔內同時檢測和分析多種生物標志物的技術。以肺癌為例,該研究證明了HNCIB系統能夠同時檢測LUAD患者和健康供體EVs的PD-L1蛋白和mRNA/miRNA表達,可見HNCIB系統能夠可靠地評估來自臨床樣本EVs中的miRNA、mRNA和蛋白表達水平。

                該技術有望成為能夠同時檢測疾病特異性EVs表面蛋白和內部分子的新平臺,有助于提高檢測的準確性,提供更全面的EVs表型和疾病狀態信息,進一步提高疾病診斷、治療動態監測及預后的敏感性、特異性和準確性。

                參考文獻:

                Zhou J, Wu Z, Hu J, et al. High-throughput single-EV liquid biopsy: Rapid, simultaneous, and multiplexed detection of nucleic acids, proteins, and their combinations.?Sci Adv. 2020;6(47):eabc1204.

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                本文由 SEQ.CN 作者:白云 發表,轉載請注明來源!

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