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                科研

                首頁 - 全部文章 - 科研 - Nat Genet | 適用于多種生物系統!單細胞染色體外環狀DNA及mRNA平行測序方法scEC&T-seq

                Nat Genet | 適用于多種生物系統!單細胞染色體外環狀DNA及mRNA平行測序方法scEC&T-seq

                檢測同一細胞中的多個參數是準確理解生物系統及其在疾病期間變化的關鍵。在環狀DNA的研究中,將DNA與轉錄組信息相結合以評估其對細胞的功能影響至關重要。近年來,表征單細胞中多種特征的技術不斷發展,但目前的方法仍難以深入表征單細胞中的環狀DNA含量、結構和序列。在癌癥中,染色體外環狀DNA(ecDNA)是癌基因快速擴增的載體,在有絲分裂期間具有獨特的復制、不均等分離能力,進而造成了細胞間拷貝數異質性,這種異質性使腫瘤能夠適應和逃避治療。此外,ecDNA還與腫瘤的侵襲性和耐藥性有關。但迄今為止,人們對ecDNA的起源、結構動力學及其對腫瘤內異質性影響的了解仍不全面。

                近日,德國柏林夏瑞蒂醫科大學、洪堡大學的研究團隊合作在Nature Genetics發表了題為“Parallel sequencing of extrachromosomal circular DNAs and transcriptomes in single cancer cells”的文章。研究團隊報告了單細胞ecDNA和轉錄組平行測序技術 “scEC&T-seq”,能夠平行檢測單細胞中所有環狀DNA類型以及全長mRNA,且不受其大小、含量和拷貝數的影響。該研究結果證明了scEC&T-seq在分析含有結構復雜的多片段ecDNA和小環狀DNA的單個癌細胞時的效用性。

                文章發表在Nature?Genetics

                主要研究內容

                scEC&T-seq能夠檢測單細胞中的環狀DNA和mRNA

                研究團隊在單細胞中對scEC&T-seq方法進行了基準檢測。首先使用流式細胞分選術(FACS)將神經母細胞瘤(NB)癌細胞分離到96孔板中;然后將DNA從聚腺苷酸化的RNA中分離出來,對其進行核酸外切酶酶切以富集環狀DNA;最后分析了環狀DNA的序列組成,并使用先前建立的計算方法推斷了環狀區域的基因組來源。

                為評估scEC&T-seq方法的性能,研究團隊首先評估了其對線粒體DNA(mtDNA)的檢測和富集。mtDNA存在于所有細胞中,可作為陽性對照。結果顯示,映射到mtDNA的reads百分比顯著增加,其他環狀DNA情況也相同,表明環狀DNA實現顯著富集。此外,研究團隊還評估了細胞周期特征基因表達,以檢測通過scEC&T-seq能否得到高質量的mRNA測序數據。結果顯示,由scEC&T-seq推斷的細胞周期分布與使用基于FACS檢測的細胞周期分布相匹配,證實了該方法的準確性。上述結果表明,scEC&T-seq不僅能夠從單細胞中分離、檢測并特異性富集環狀DNA,還可以并行測序癌癥單細胞中的高質量、完整的轉錄本mRNA。

                圖1. scEC&T-seq能夠富集和檢測單細胞中的環狀DNA。來源:Nature Genetics

                scEC&T-seq可檢測單細胞中的復雜多片段ecDNA

                研究團隊探索了scEC&T-seq能否提供ecDNA結構相關信息。結果顯示,scEC&T-seq在幾乎所有單細胞中都捕獲了多片段ecDNA,重現了先前在大量群體中發現的元件結構。通過對ecDNA連接跨reads和結構變異(SV)進行量化,研究團隊基于短讀長和長讀長測序證實了上述片段的互聯性,并發現scEC&T-seq可以在單細胞中鑒定融合轉錄物。綜上,scEC&T-seq檢測ecDNA相關SV和單細胞中由此產生的融合基因表達的靈敏度較高。

                圖2. scEC&T-seq可捕獲單個癌細胞中多片段ecDNA的復雜結構。來源:Nature Genetics

                細胞間ecDNA含量差異驅動表達差異

                ecDNA的不平等有絲分裂分離意味著ecDNA拷貝數在單個細胞之間可能存在很大差異。在大多數單細胞中,多片段ecDNA在結構和組成上沒有差異,表明ecDNA在培養細胞系中結構穩定。但少數細胞只包含獨立ecDNA的一個子集,這意味著ecDNA含量的變化可能導致了種群異質性。

                研究團隊分析了ecDNA拷貝數異質性是否影響ecDNA上的編碼基因表達。結果顯示,相對ecDNA拷貝數分布與基于FISH檢測的拷貝數分布一致。SNP分析表明,ecDNA在癌癥單細胞中都是單等位基因來源。此外,與拷貝數驅動的基因表達差異一致,相對ecDNA拷貝數與同一單細胞中ecDNA上所含基因的mRNA reads數量呈正相關。上述結果表明,ecDNA拷貝數異質性是細胞間癌基因表達差異的主要決定因素。

                圖3. 細胞間ecDNA含量差異驅動基因表達的差異。來源:Nature Genetics

                scEC&T-seq可檢測ecDNA和mtDNA中的SNV

                此外,研究團隊在合并的單細胞scEC&T-seq數據上應用了SNV檢測算法,將檢測到的SNV與大規模群體的全基因組測序鑒定的SNV進行了比較,發現scEC&T檢測的大多數SNV也在全基因組中檢測到(>?69.5%)。

                因為scEC&T-seq也檢測mtDNA,研究團隊假設異質性線粒體突變可以進行譜系追蹤。結果顯示,通過同質mtDNA變異體進行的無監督等級聚類準確地對細胞進行了基因分型,mtDNA上的異質SNV揭示了高度的細胞間異質性。因此,scEC&T-seq可以檢測mtDNA和ecDNA中的異質性變異,允許廣泛的SNV檢測應用和分析,包括譜系推斷。

                scEC&T-seq解析原發性神經母細胞瘤中的環狀DNA

                研究團隊將scEC&T-seq應用于兩個神經母細胞瘤單細胞和兩個不同患者來源的活T細胞中。與正常T細胞和細胞系細胞相比,癌細胞中環狀DNA的數量顯著較高,表明腫瘤中的DNA環狀化比未轉化細胞或培養細胞更頻繁。環狀DNA的大小分布和相對基因組含量與在細胞系中觀察到的相當,表明不管檢測樣本如何,scEC&T-seq均可重復捕獲環狀DNA。

                研究團隊在兩名患者幾乎所有癌細胞中都檢測到含有致癌性MYCN基因的ecDNA,并在細胞系中觀察到MYCN轉錄的細胞間差異與相對ecDNA含量呈正相關。上述結果表明scEC&T-seq可以成功地應用于人類腫瘤的研究中。

                圖4. scEC&T-seq在單細胞水平檢測原發性神經母細胞瘤中的環狀DNA。來源:Nature Genetics

                結語

                該研究證明通過對單個癌細胞的環狀DNA和轉錄組進行平行測序,scEC&T-seq不僅可以很容易地區分ecDNA驅動的細胞間癌基因拷貝數異質性的轉錄后果,并具有揭示ecDNA結構進化原理的潛力。在單個癌細胞中進行scEC&T-seq能夠獨立于拷貝數和環狀DNA大小來描繪它們的環狀DNA含量,并在活的單細胞中發現了小的環狀DNA,表明凋亡不是它們產生的唯一機制。scEC&T-seq適用于多種生物系統,通過該方法對細胞環狀DNA含量和轉錄組的綜合分析,可進一步探索單細胞中環狀DNA的多樣性和不變性。scEC&T-seq將幫助人們更全面地了解環狀DNA在癌癥及其他疾病中的范圍、功能、異質性和進化,其在未來有望成為許多其他領域研究的重要手段。

                參考資料:
                Chamorro González, R., Conrad, T., St?ber, M.C. et al. Parallel sequencing of extrachromosomal circular DNAs and transcriptomes in single cancer cells. Nat Genet 55, 880–890 (2023).
                https://www.nature.com/articles/s41588-023-01386-y
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                本文由 SEQ.CN 作者:戴勝 發表,轉載請注明來源!

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